Phos-tag SDS-PAGE データ集 FixLJ

バクテリアの情報伝達経路には，ヒスチジンとアスパラギン酸による
リン酸基転位反応によって行われるものがあり，
二成分伝達系と言われます。

外界の環境変化を捉えるセンサーキナーゼ（ヒスチジンキナーゼ）と
レスポンスレギュレータのペアから成ります。

センサーキナーゼのヒスチジンが自己リン酸化によってリン酸化し，
そのリン酸基がレスポンスレギュレータのアスパラギン酸に転移されます。
レスポンスレギュレータ〜は転写因子として支配下の遺伝子発現に関わります。

本実験は，Sinorhizobium meliloti の　二成分伝達系FixL/FixJ
のin vitro kinase assayです。
His-tagタンパク質として発現，精製したものです。

「FixL autophosphorylation」はFixLがATP存在下で自己リン酸化する様子を
Mn²⁺–Phos-tag SDS-PAGEで解析しています。
FixLのHis275がリン酸化したものがシフトアップしています。

「FixL /FixJ phosphotransfer」はFixLがATP存在下で自己リン酸化し，
そのリン酸基がFixJ に転移する様子を解析しています。
FixJのAsp54がリン酸化したものがシフトアップしています。

さらに興味深い事に，FixJのHis84がリン酸化したものが
Asp-54のリン酸化よりも時間的に遅れて観察されます。

FixJにおいては，Asp-54のリン酸基が加水分解される前に，
近傍のHis-84に一旦，リン酸基を転移し，その後加水分解されるものと考えられます。
（この現象が他のレスポンスレギュレーターにも共通のものかどうかはわかりません。）

FixLJにおけるリン酸基転移反応を模式的に表すと次のようになります。
FixLJ img

また，FixJのAsp-54~P が加水分解される際に，
一旦，His-84にリン酸基が転移する事について
活性型FixJではAsp-54の近傍にHis-84が位置していることから（下図）
偶発的な現象である可能性もあります。
機能上の意義はわかりません。

FixJ structure

なお，FixJのAsp-54~P とHis-84~Pが異る移動度を示すことから，
リン酸基数が同じでもリン酸化部位が異なれば，分離されることがわかります。