Phos-tag SDS-PAGE database EnvZ

バクテリアの情報伝達経路には，ヒスチジンとアスパラギン酸による
リン酸基転位反応によって行われるものがあり，
二成分伝達系と言われます。

外界の環境変化を捉えるセンサーキナーゼ（ヒスチジンキナーゼHK）と
レスポンスレギュレータのペアから成ります。

センサーキナーゼのヒスチジンが自己リン酸化によってリン酸化し，
そのリン酸基がレスポンスレギュレータのアスパラギン酸に転移されます。
レスポンスレギュレータ〜は転写因子として支配下の遺伝子発現に関わります。

本実験は，E.coli の　二成分伝達系EnvZ/OmpR
のセンサーキナーゼ EnvZ の in vitro kinase assayです。
EnvZ はHis-tagタンパク質として発現，精製したものです。

EnvZは，HKドメインにはATP結合部位(G-box)があり，
そこからH243にリン酸基が転移されます。
EnvZ は二量体を形成しており，
その転移反応はサブユニット間の「trans」転移であることがわかっています（下図）。

EnvZ scheme

WTのEnvZ では，リン酸基が転移されて，リン酸化型EnvZ がシフトアップします。

一方，ATP結合部位のG2 boxのグリシンをアラニンに置換(G401A/G403A)すると
リン酸基転移反応が起こらず，シフトアップは見えません。

また，リン酸化部位であるH243をアラニンに置換(H243A)しても
リン酸基転移反応が起こらず，シフトアップは見えません。

G401A/G403A　と　H243A　を等量混合した場合は，
in vitro でサブユニット交換が起こり
ホモダイマーとヘテロダイマーが（理論上は１：１で）生成し，
互いに相補的にリン酸基転移反応を起こし，リン酸化型のシフトアップが見られます。

このことより，EnvZ のリン酸基転移反応が「trans」であることが確認されました。

EnvZ 以外の，リン酸基転移反応の機構が未知の二成分伝達系　HKについて，
Phos-tag SDS-PAGEを用いて，cis, trans を明らかにしています（関連画像参照）。